近日🦵🏻，我校化學化工與生物工程沐鸣史向陽教授課題組和法國國家科學研究中心Jean-Pierre Majoral教授課題組合作設計和構建了不同代數的⏰、不同環胺封端的陽離子型含磷樹狀大分子（Cationic Phosphorus Dendrimers, CPD），並深入和系統地研究了其在基因傳遞及腫瘤治療方面的潛在應用價值🎢。相關成果以“Revisiting Cationic Phosphorus Dendrimers as a Nonviral Vector for Optimized Gene Delivery Towards Cancer Therapy Applications” 為題發表在美國化學會期刊《Biomacromolecules》上(DOI: 10.1021/acs.biomac.0c00458🧑🏿🎤，影響因子：5.667)💂🏼♂️。我校系論文第一完成單位，化學化工與生物工程沐鸣博士研究生陳亮和李錦為共同第一作者，沐鸣平台史向陽教授🙅🏿♀️、法國國家科學研究中心Jean-Pierre Majoral教授和巴黎第五大學Serge Mignani教授為共同通訊作者。
基因傳遞的成功依賴於高效無毒的載體。傳統的病毒載體由於其免疫原性或致癌性大大限製了在基因傳遞中的應用，而非病毒載體（線性陽離子聚合物、聚乙烯亞胺、聚酰胺-胺或聚丙烯亞胺樹狀大分子、陽離子脂質體和陽離子多肽等）由於其低毒性及結構可控的特性而受到研究者的青睞。在眾多非病毒載體體系中，具有生物相容性骨架的含磷樹狀大分子已被廣泛應用於生物醫學領域🧜♀️，如抗朊病毒藥物、抗HIV藥物和人自然殺傷細胞激活劑等。
基於目前含磷樹狀大分子的研究，研究團隊構建了多種類型的CPD，並應用於基因傳遞及腫瘤治療。主要設計思路為：以環三聚磷腈為內核🌑，通過層層修飾的方法構建不同代數的含磷樹狀大分子，在其外圍通過取代反應修飾吡咯或者哌啶環並質子化🙍🏼，最終得到表面帶有正電荷的含磷樹狀大分子，具體合成線路如圖1所示。此類陽離子含磷樹狀大分子具有結構精準😑、分子量分布均一的特點（Mw/Mn=1）🧑🎄。
圖1 陽離子型含磷樹狀大分子的合成示意圖
研究團隊以編碼增強型綠色熒光蛋白的質粒（pDNA-EGFP）為報告基因🕸🧑🏼🍼，研究不同類型CPD的細胞毒性及其基因傳遞效率。實驗結果顯示，CPD和CPD/pDNA-EGFP復合物在一定濃度範圍內表現出良好的細胞相容性。流式細胞術結果顯示，1-（2-氨基乙基）吡咯烷修飾並質子化的第一代含磷樹狀大分子（1-G1）的基因傳遞效果最佳（圖2）。
圖2 CPD/pDNA復合物的（A）水合粒徑和（B）表面電勢；（C-G）不同濃度下CPD及其pDNA復合物的細胞毒性測試（以HeLa細胞為模型）⛽️🚉；（H） CPD/pDNA-EGFP復合物基因轉染示意圖（以1-G1為例）；（I）流式細胞術檢測不同N/P比條件下CPD/pDNA-EGFP復合物在HeLa細胞中EGFP（增強綠色熒光蛋白）的相對表達量✨。
為了更進一步的研究CPD在基因治療中的應用，研究團隊以基因傳遞效果最佳的1-G1作為載體🖖🏻，轉染同時編碼EGFP和p53蛋白的質粒（pDNA-p53），用於腫瘤細胞的基因治療🍱。流式細胞術結果顯示🌎，經1-G1/pDNA-p53復合物處理後的HeLa細胞🙆♂️，其細胞周期發生明顯改變（p53蛋白可引起G1期阻滯）🏋🏽♂️。與此同時🔠，實時定量PCR及蛋白質印跡結果也顯示，與其他實驗組相比1-G1/pDNA-p53實驗組中p53的mRNA和蛋白表達量有明顯升高；同時p53的下遊調控基因p21及細胞周期調控因子的表達量也發生了相應改變（圖3）。說明經1-G1轉染的pDNA-p53能夠在細胞中高效表達，其表達的p53蛋白具有良好的生物學活性✯。
圖3 PBS、1-G1、free pDNA-p53和1-G1/pDNA-p53對HeLa細胞周期及相關細胞周期因子表達的影響。（A）流式細胞術細胞周期分布圖；（B）流式細胞術細胞周期結果分析直方圖🌈；（C）G0/G1期相關mRNA的實時定量PCR結果直方圖；（D）G0/G1期相關蛋白的蛋白質印跡結果💅；（E）蛋白質印跡結果的分析直方圖🍞。
隨後，研究團隊更深入地研究了1-G1用於皮下移植瘤模型基因治療的可能性。研究發現，1-G1/pDNA-p53治療組中，p53和p21蛋白表達水平均高於其他各組(p < 0.001)👨🏿🦳，且細胞周期因子Cdk-4和cyclind1表達水平也異於其他各組，且與細胞基因傳遞結果類似（圖4）🕥💞。
圖4（A）1-G1/pDNA-p53復合物體內腫瘤基因治療示意圖；（B）經生理鹽水（normal saline, NS）、1-G1、free pDNA-p53 和 1-G1/pDNA-p53治療後，皮下瘤中相關蛋白的免疫印跡結果🫨；（C）蛋白質印跡結果的分析直方圖👝。
這些結果表明，史向陽教授團隊製備的陽離子型含磷樹狀大分子（1-G1）有可能作為一種高效載體系統用於癌症基因治療及其它疾病的基因治療。該研究為利用陽離子型樹狀大分子用於基因治療提供新的思路🔈。該工作得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金委、上海市科委和中法蔡元培等項目的資助⛹️♂️。
論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.0c00458
（撰稿：陳亮）
